本品系用阿维菌素药物偶联蛋白的抗原、阿维菌素类药物多克隆抗体和酶标记羊抗兔及其它试剂制成。用于定量、定性检测牛组织中阿维菌素类药物的残留量。

【物理性状】  试剂盒外观完整，内装试剂齐全。包被抗原的酶联板透明干燥且用真空包装。阿维菌素类药物抗体工作液、底物液、终止液、阿维菌素标准品溶液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液为透明溶液，酶标记物为浅黄色溶液，试剂无菌检验均应合格。

【灵敏度测定】  取已包被好的酶标板12孔，每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液各20µL，再加入抗体工作液80µL，用盖板膜盖板，37℃环境中反应30min，取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4－5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干，加入100µL酶标二抗，37℃反应30 min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50µL，避光37℃反应15 min，用50µL终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以AVM浓度（µg/L）的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。

IC50（即0浓度标准溶液的吸光度值50％处所对应的AVM浓度）范围应在2.32µg/L ~4.57µg/L之间。

【特异性测定】  取已包被好的酶标板18孔，每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液和牛肉样品提取液、20µg/L和50µg/L两个浓度阿维菌素添加的牛肉样本提取液各20µL，再加入抗体工作液80µL，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100µL酶标二抗，37℃反应15 min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50µL，避光37℃反应15 min，用50µL终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以AVM浓度（µg/L）的自然对数为X轴，百分吸光度为Y轴，绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和20µg/L和 50µg/L两个浓度阿维菌素添加的组织样品的测定浓度。

阴性样品测定值在3µg/L以下，以20µg/kg 和50µg/kg 两个浓度阿维菌素样本进行添加，回收率应在60.0%~120.0％以上。

【精密度测定】  取已包被好的酶标板32孔，每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液20µL，其它20孔加入4.5µg/L的标准溶液20µL，再加入抗体工作液80µL，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100µL酶标二抗，37℃反应30 min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50µL，避光37℃反应15 min，用50µL终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。

20个微孔的4.5µg/L标准溶液的光吸收值变异系数（%）应≤25%（n=20）

【适用范围】　用于定量、定性检测牛组织（肌肉、肝脏）中阿维菌素类药物的残留量。

【用法和结果判定】

1.  溶液配制

1.1  稀释复溶液：将2X浓缩复溶液摇匀，用水以1：2比例稀释，临用前配制。

1.2  稀释洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用水以1：20比例稀释，临用前配制。

2.  样品前处理

2.1  牛组织（牛肉、牛肝）样本处理方法

2.1.1  取牛组织（肌肉、肝脏）进行均质。

2.1.2  称取2±0.05g样品，加入8mL乙腈，振荡提取20min，3000g以上离心10min，取上清液5mL备用。

2.1.3  取sep-pak vac12cc(2g)柱，称取3g无水硫酸钠平铺在滤板上，加入10mL乙腈溶液。 

2.1.4  加入提取液5mL，收集滤液，待提取液流干，再加入4mL乙腈清洗残留液。

2.1.5  将收集滤液置60℃下氮气吹干，加入1mL稀释了的复溶液复溶。

2.1.6  取20µL进行分析。

3.  检测步骤

3.1 将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20~24℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

3.2 取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃不要冷冻。

3.3 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。

3.4 用加样器每孔加标准品或样本20mL 后，每孔再加80mL抗体溶液。

3.5 用盖板膜盖板后置于37℃环境反应30min。

3.6 小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液每孔250mL充分洗涤4~5次，每次间隔10~20s，用吸水纸拍干。

3.7 加酶标记物：每孔加入100mL。用盖板膜盖板后置37℃环境反应30min，取出重复洗板步骤。

3.8 显色：每孔加入底物液A液50mL，再加底物液B液50mL，轻轻振荡混匀37℃环境避光显色15min。

3.9 测定：每孔加入终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定每孔OD值。

4.  结果判定 
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值

以阿维菌素浓度的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。

【贮藏条件和保存期】试剂盒应在2~8℃保存，保存期为6个月。

【规格】每个试剂盒含96孔板一块；AVM标准品6瓶，1mL/瓶（0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L）；抗体工作液1瓶，10mL；酶标记物工作液1瓶，12mL；20倍浓缩洗涤液1瓶，40mL；2倍浓缩复溶液1瓶，50mL；底物液A液1瓶，7mL；底物液B液1瓶，7mL；终止液1瓶，7mL；高浓度标准品（1µg/mL）1瓶，1mL；盖板膜1张；自封袋1个；说明书1份；质量报告1份。

【注意事项】

1、剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌，防止试剂变质。

2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。

3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证，合格后方可用于特异性和准确度监控用。

4、严格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。

5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象，则视该批试剂盒为不合格。